介绍
通过小分子对蛋白质功能的调控构成了开发新型药理疗法的主要策略。致力于该主题的许多计算工具中，分子动力学(MD, Molecular Dynamics)模拟是最强大的工具之一。过去的十年中，由于专用超级计算机和基于GPU的技术，MD的性能得到了提升。再加上更高效的采样方法，越来越长的时间尺度的探索变得更加容易。这样的升级已经逐步转化为对计算要求更高的实验，比如游离配体结合研究。自由配体结合中，蛋白质和配体被分开放置，通过启动多个平行模拟，研究自发的结合事件。这种近似方法可以研究蛋白质与配体结合的决定因素及其作用机制以及动力学参数。
类似的研究还没有在同样的程度上应用于内在无序蛋白(IDPs, intrinsically disordered proteins)。IDPs广泛存在于真核生物的蛋白质组中，其中高达30%的蛋白质至少含有一个无序区域。尽管缺乏稳定的三维构象，但它们还是发挥了其生物功能，它们作为关键的中间体参与复杂的信号网络。因此，它们的功能失常可能导致致癌和神经退行性病变。然而，它们并不被认为是可行的药物靶点，因为大多数方法更适合与折叠的蛋白质工作。 因此，关于IDP-小分子调控的例子的数量是有限的。一些实验性的近似方法已经被用来识别与蛋白质的无序区域相互作用的小分子，如cMyc、RNA螺旋酶A、NUPR1、雄激素受体和PTP1B。该领域的计算研究提出了所谓的 "配体云围绕蛋白质云 "模型，该模型指出相互作用是通过模糊复合物而不是通过刚性构象发生的。 最近的一个例子是，利用NMR筛选，发现了几个与p27蛋白相互作用的小分子(特别是一个被称为SJ403的小分子)。p27是一个真核细胞细胞周期控制器，它阻断了周期依赖性激酶Cdk2-cyclin A复合物的功能。该蛋白在分离时是无序的，但短区域与其他蛋白结合后会发生无序到有序的转变，如子域D1和D2。尤其是D2子域的50个残基负责与SJ403的相互作用。从实验数据得出的结合模型提出，小分子的加入会诱导D2子域的群体转变，而不是扩大构象空间。SJ403被证明破坏了一组疏水残基之间的相互作用，其中一些残基也是结合的关键参与者。 研究的D2子域和小分子SJ403之间的结合。为此，研究人员使用全原子无偏MD模拟与马尔科夫状态模型(MSMs)和新型自适应采样算法相结合。确定的结合构象表现出结合诱导的刚性区域与其他保留其模糊性的混合物。此外，蛋白质-配体结合的构象与分离的p27之间的比较揭示了构象空间探索的减少和蛋白质内接触的破坏，与实验观察一致。总的来说，研究体现了MD在理解IDPs能量格局中小分子的影响方面的未被开发的潜力。
方法
分子动力学模拟设置 为了研究蛋白质与配体的结合，研究人员使用p27的D2子域，类似于NMR研究中采用的子域。该区域是用于结晶p27KIP1-Cdk2-环素A的较长构象的一部分，p27的残基54-101用PyRosetta构建。接下来，扩展的构象被折叠使用一个简短的隐式溶剂模拟。然后，研究人员产生了一个初始池的未折叠构象的p27通过模拟所产生的肽在显性溶剂与TIP3P水模型。 研究人员进行了两个实验：一个是蛋白质在溶液中，另一个是蛋白质和配体在溶液中。所有系统均采用HTMD构建，采用了CHARMM22*力场，对原始CHARMM22进行了修改，调整了主干扭转势，以产生更多的扩展构象。平衡后，没有检测到脯氨酸顺式异构体。使用分布式计算项目GPUGrid运行ACEMD模拟引擎，遵循自适应采样策略，在310 K下进行80 ns的动力学模拟运行。 利用AdaptiveBandit进行自适应采样 自适应取样旨在通过基于已经生成的数据催生新一轮的模拟来有效探索构型空间。一个epoch后，MD数据被分析，一个策略选择那些更感兴趣的结构作为新一轮模拟的初始构型。这里采用的策略称为AdaptiveBandit(包含在HTMD中)。 分子参数化
马尔科夫状态模型(MSM)分析 使用HTMD进行MD数据分析。对于p27-SJ403数据集的数据特征化是使用蛋白质重原子和SJ403重原子之间的距离进行的。对于p27数据集，使用Cα和侧链氮原子和氧原子之间的距离。然后，按照类似的过程建立MSM与每个集。特征化数据被投射到一个较低的三维空间，通过使用TICA在20帧的滞后时间。之后，使用MiniBatchKMeans算法分别对p27-SJ403和p27数据集的TICA衍生数据进行聚类成1.500和800个状态。最后，微观状态被融合成三个宏观状态，在20 ns的滞后时间为这两个集按照隐含的时间尺度绘图。 对于每个措施，通过创建10个独立的MSM使用随机集包含80％的模拟轨迹的误差估计。 MD模拟比较 一旦所有的模拟完成后，研究人员比较了在小分子存在或不存在的情况下观察到的构象景观的独特探索。 特别是，该方案使用两种不同的指标（二面体和蛋白质接触）和两种不同的维度减少方法（TICA和PCA）进行了多次应用。拥有所有这些组合的目的是为了避免可能的偏差，无论是由度量还是由维度减少方法引起的。 结果与讨论 结合态的鉴定与结构分析 在IDP-配体结合的情况下，蛋白质和蛋白质-配体构象都是高度可变的。蛋白质-配体之间的相互作用不太可能是稳定的，IDPs都不会在结合后变得完全刚性。因此，必须同时评估蛋白质的刚性和蛋白质-配体的方向。为了解决这个问题，从蛋白质-配体适应试验获得的MD数据用于基于蛋白质和配体重原子之间的距离构建MSM。将得到的MSM包括三个亚稳状态：其中的两个功能稳定的接触，第三个保持展开状态，没有形成任何稳定的蛋白质-配体接触。 溶液中的P27 额外的MD运行与无序的p27蛋白在溶液中。得出的MSM包括两个宏态，其特点是疏水残基之间的簇状接触(W60-Y88和W76-Y88)。它们在p27的构象表面配置了部分有序状态，并占平衡的2%。这些残基之间的相互作用也被实验报道为根据NMR数据定义p27的基础状态的疏水残基W60、W76和Y88三者之间更复杂的接触网络的一部分。这两种宏态也包含了最刚性的结构。然而，在这种情况下，没有明显的隔离与最填充状态 。此外，残基69和90-95保持刚性构象在所有的宏观状态，类似于p27-SJ403数据集。最后，还发现了第三种高度填充且结构异质的状态。 小分子添加对构型的影响 关于IDP-配体结合的主要问题之一是分子的加入将如何影响IDP的构象。有两种相反的情况是可能的。第一种情况下，分子通过促进未知区域的探索，扩大了可用结构。第二种情况下，分子限制了构象空间的填充区域，导致状态之间的群体转移。对于p27-SJ403系统，实验数据支持后者；观察到SJ403的加入破坏了蛋白内接触的形成，尤其是中央和C端部分之间的接触。 结论 IDP-配体调控的背景下，MD数据的分析能够提供p27-SJ403结合的构象，与实验信息一致。这些蛋白-配体复合物保留了部分内在的灵活性，而短线拉伸的氨基酸在结合后变得更硬。另一方面，刚性的蛋白质构象也出现了。然而，它们并不能提高一个稳定的状态，因为它们招致了高熵成本，而这种成本并没有得到焓补偿。 最拥挤的结合状态下，残基W60和W76是形成复合物的关键，但与折叠蛋白相反，姿势是通过多个不同的接触来稳定的。这是由于相互作用的疏水性。在大多数情况下，色氨酸环之间小分子的堆积维持了相互作用。 驱动这种过程的主要相互作用依赖于疏水残基在预定义的结合界面中的埋藏，正如包括p53-Mdm2或KIX-cMyb在内的蛋白质-IDP复合物所证明的那样。这导致IDPs在与它们的折叠伙伴相互作用时，通过结合后的折叠变得完全刚性。在其他情况下，如聚电解质链，蛋白质复合物是由极性相互作用和电荷互补所介导的，它们不需要特定的残基-苷质接触或结合位点，因此在相互作用后基本上保持无序状态。因此，这里观察到的p27-SJ403结合代表了这两种行为之间的中间点。 参考资料 Small Molecule Modulation of Intrinsically Disordered Proteins Using Molecular Dynamics Simulations. Pablo Herrera-Nieto, Adrià Pérez, and Gianni De Fabritiis. Journal of Chemical Information and Modeling 2020 60 (10), 5003-5010. DOI: 10.1021/acs.jcim.0c00381 
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