计算方法 分子动力学模拟（Molecular Dynamics Simulations） 计算软件 AutoDock4 AutoDock Vina HTMD ACEMD 介绍 蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)的调控正在成为药物发现过程中的一个重要目标。PPI抑制剂可以被设计成实现高特异性结合，以干扰靶蛋白复合物的形成。细胞凋亡蛋白(IAPs)是一个蛋白家族，其过度表达与肿瘤的发生、进展、侵袭、化疗抗性和不良预后相关.IAP介导的PPI是癌细胞存活的关键，是癌症治疗的最佳靶点。IAPs包含1至3个BIRs域，根据是否存在一个独特的裂隙，称为IBM沟槽，可分为I型和II型。因此，I型和II型BIRs利用其表面的不同区域与各种细胞伙伴建立特定的相互作用，以抑制细胞凋亡，促进细胞存活。抗癌药物的发现研究多以 "SMAC-mimetic "抑制剂针对II型BIRs，但遗憾的是，在一些癌细胞系中发现了耐药机制。 细胞IAPs(cIAP1和cIAP2)参与了规范和非规范NF-κB途径的紧密调节。在此背景下，cIAPs作为E3连接酶泛素化RIPK1和NIK，分别促进细胞存活和防止促炎分子的释放。I型BIRs通过与TRAF2的相互作用介导cIAPs招募到TNFR1/2，是cIAPs的E3连接酶活性严格要求的这种相互作用。BIR1介导的PPIs代表了一个创新的靶标，以寻找诱导细胞死亡的替代或支持策略。 这项工作中，研究人员解决了I型BIR介导的复合物的组装问题，通过基于结构的计算筛选来寻找NF-κB调节剂，从而得到了NF023，一个suramin类似物，作为定向优化的候选物。 实验方法 前期对接筛选 使用AutoDock4在cIAP2-BIR1(PDB ID: 3M0D)上使用药理活性化合物库进行初步的虚拟筛选，产生了1249个化合物的排序列表，预测的结合自由能值(ΔG)在-0.66和-9.27kcal/mol之间。缺失的化合物显示出正的ΔG。 分子动力学 通过HTMD的ProteinPrepare算法在pH7下分配侧链的状态。根据其金属中心几何形状调整锌配位残基的质子化状态。用Antechamber软件包的RESP方法分配部分电荷，并使用GAFF2力场进行参数化。 初步配置的准备 为了优化结合和非结合配置空间的计算探索，研究人员准备了五个系统，每个系统都包含一个cIAP2-BIR1域加上一个NF023分子在溶剂中的不同位置和方向。NF023的初始坐标是从PDB配体(ID: 0BU)中提取的。五个系统是通过翻译配体的中心在一个34 Å半径的球体上随机选择的点在BIR1中心产生的。每个系统与TIP3P水溶解在73×73×73 Å盒，中和和电离到150mM氯化钠离子强度，并能量最小化，以减少立体冲突。系统在恒压和温度条件下(1 atm，300 K)预平衡1 ns，蛋白质和药物的重原子的谐波约束线性趋近于零。 体系的制备和构建是用HTMD包进行的。所有的模拟都是用ACEMD软件在GPUGRID分布式计算网络上运行。 cIAP2-BIR1/NF023的大规模动力学模拟 每个发生器的平衡配置被用作50个副本的初始条件，每个运行过程中，蛋白质和配体都是不受限制的，因此，它们表现出配置变化以及在模拟盒中的翻译和旋转扩散。模拟包括248×300 ns≃75μs的无偏取样的总和。 研究人员将结构分析限制在每个轨迹的最后一帧，以最大限度地提高 "约束 "配置空间的样本的独立性。NF023在蛋白质表面上的扩散是相对缓慢的每个轨迹的采样时间尺度。考虑到可获得的时间尺度和数据的可用性，合集平均比时间平均更可取。请注意，由于恒温器提供的随机化，由相同初始条件产生的轨迹很快就会相互关联。 动力学模拟结果的聚类 为了确定在248条轨迹的每条轨迹的末尾最能统计地表示的NF023的姿态，研究人员搜索了复合方向的簇。更具体地，考虑到对称性，建立了包含从最终框架的成对结构比较中计算出的RMSD值的矩阵。使用成对的最大RMSD 2.0Å和每个群集三个副本的最小填充作为选择属于同一群集的副本的标准。NF023的硫原子和中心碳原子的坐标用于RMSD计算，这说明了该化合物的化学对称性。 系综重对接分析 克隆与突变 cIAP2-BIR1形式和TRAF2的表达和纯化 尺寸排阻色谱 热稳定性测定 微量热泳 结果 鉴定NF023为cIAP2-BIR1配体 NF023是药物suramin的类似物，目前是治疗引起非洲昏睡病和河盲症的寄生虫的首选药物。将NF023作为TRAF2/cIAP2蛋白-蛋白组装拮抗的模型，是因为NF023是XIAP-BIR1的已知配体，其结构和功能类似于cIAP2-BIR1的域。此外，针对仅参与亲生存PPI的cIAP2-BIR1与TRAF2的界面区域的LOPAC库的初步对接筛选，在6个得分最高的命中中产生了NF023。在最佳得分构象中，NF023被发现与cIAP2-BIR1的α1-α2区域相互作用，在复合物中平行于TRAF2轴运行。第二最佳姿势包括弯曲的NF023构象，几乎能够拦截α1和部分α2，但也能到达β片区域。这些初步数据促使通过体外和硅片相结合的方法对NF023的作用模式进行了彻底的生物物理表征。 自由结合的MD轨迹 NF023是一种重度磺化的化合物，预期会出现混杂现象。为了获得NF023与cIAP2-BIR1结合的详细图片并描述可用于药物开发的热点，研究溶于进行并分析了248套无偏的全原子MD模拟，总共约75μs采样。 最终帧系综聚类 一组轨迹的可用性允许使用实验部分中所述的统计方法来揭示与高电荷且灵活的NF023分子一致的复杂结合态。在最终构象的集合中进行的聚类过程是在配体姿势中截取3Å RMSD的界线，鉴定出四个不同的结合簇，此处标记为C1至C4。重要的是，四个中的两个位于BIR1域和TRAF2之间的接口处。这些簇中，化合物位于界面表面的底侧在α2和α3螺旋之间。集群C1和C4离TRAF2接口更远；在这两个簇中，该化合物都位于C末端附近，在α2和β1周围形成的长裂缝内。 系综重对接 系综重对接旨在发现可能的诱导结合和隐性口袋，发现三个结合姿势与预测的整体自由能值低至-9.5 kcal/mol。 NF023在BIR1上有多个相互作用区 自由结合模拟的结果与最终簇一起，支持NF023结合到蛋白质表面的杂乱性质。从对更频繁地与NF023形成接触的蛋白质残基的考虑和从簇分析出发，研究人员确定了BIR1域表面上参与配体相互作用的主要区域。 体外绘制NF023与cIAP2-BIR1结合的图谱 根据从计算对接和MD模拟中获得的结果，并为了验证NF023的结合模式，研究人员对cIAP2-BIR1进行了诱变实验。特别是，在α1区域、α2区域和β1链中插入了点突变。β3-α3环区域具有很强的流动性，因此在蛋白质点突变选择中被舍弃。点突变的选择也是以Zheng等人报道的现有数据为指导，其中cIAP2-BIR1突变体在下拉实验中保留TRAF2的能力进行了评估。 除了R48A表现出最低的熔化温度值,表明其稳定性较差外,其他突变体在水合形态和热稳定性方面与野生型蛋白相似。用MST测定NF023对cIAP2-BIR1野生型和突变型的亲和力。这种实验背景下，最不稳定的突变体R48A，没有显示出合适的荧光信号，无法进行测试，可能是由于标记程序的缓冲条件。Kd值和标准偏差是在三次独立实验中计算出来的。S34A和Y56A的取代阻止了NF023的结合，表明这些残基的侧链对cIAP2-BIR1/NF023加合物的形成至关重要。 参考资料 Computational and Experimental Characterization of NF023, A Candidate Anticancer Compound Inhibiting cIAP2/TRAF2 Assembly. Federica Cossu, Luca Sorrentino, Elisa Fagnani, Mattia Zaffaroni, Mario Milani, Toni Giorgino, and Eloise Mastrangelo. Journal of Chemical Information and Modeling. 2020 60 (10), 5036-5044 DOI: 10.1021/acs.jcim.0c00518
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